當底物發生化學反應而產生的能量以光的形式釋放出來的時候，我們稱這個過程為化學發光。魯米諾（luminol）是zui常用的化學發光試劑之一，被過氧化物氧化后它會產生一種激發態的產物——aminophthalate。這種產物衰變至低能態的同時釋放出光子。添加物可以提高魯米諾反應的發光強度和持續時間以及靈敏度。
    化學發光底物被廣泛使用是因為其具有其他檢測方法不具備的優點，這些優點使得化學發光成為大多數蛋白實驗室的檢測方法。使用化學發光可以通過多次曝光獲得的成像結果。還可以將檢測試劑*去除，再對其他目的蛋白進行檢測并成像，或對檢測條件進行優化。具有很寬的線性響應范圍，從而可以檢測并定量很寬濃度范圍的蛋白質。zui重要的是，化學發光在所有的檢測方法中具有zui高的靈敏度。使用辣根過氧化物酶標記的抗體和G-Biosciences公司的femtoLUCENT™ PLUS （貨號 # 786-003），可以檢測的下限為飛克級，而這得益于這種底物中的增強劑可以很大程度地增強發光強度并提高靈敏度。
     化學發光底物與其他底物不同之處在于只有在酶和底物發生反應的時候才會產生瞬時的可被檢測的光。這與那些可產生穩定有顏色產物的底物不同；些有顏色的沉淀在酶-底物反應結束之后仍然存在于膜上。在化學發光免疫印跡中，底物是反應限制試劑。一旦其耗盡，光就會逐漸變弱并消失。實驗中一定要使用適當稀釋濃度的抗體，這樣才會在幾小時內產生穩定的光信號輸出，從而維持蛋白檢測的一致性和靈敏度。當抗體沒被足夠稀釋時，永遠不會獲得穩定的光信號輸出。系統中太多的酶會快速氧化底物并終止信號。

化學發光，魯米諾在HRP和雙氧水存在的條件下會被氧化形成激發態的產物（3-aminophthalate）。3-aminophthalate在衰變至基態的過程中會發出波長為425nm的光。

femtoLUCENT™ PLUS

化學發光的優點